猪伪狂犬病（porcine pseudorabies，PR）又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科猪疱疹病毒1型所引起的猪、羊、牛等多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒（猪除外）脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。各种年龄的猪均易感。世界上40多个国家均有本病的报道，国内也有大范围的流行，对养猪业造成了严重的经济损失。本文从临床诊断方法、病原学诊断方法、免疫学诊断方法及分子生物学诊断方法四个方面将近年来对猪伪狂犬病的诊断技术研究综述如下：
1 临床诊断方法
猪感染猪伪狂犬病病毒（PRV）后，2周龄以内的哺乳仔猪，病初发热、呕吐、厌食、下痢，精神不振，眼球上翻，视力减退，呼吸困难，呈腹式呼吸；共济失调，倒地后出现四肢呈划水样动作的神经症状；最后衰竭死亡，死亡率达100%。3~4周龄的猪也有上述临床症状，但病程略长，病死率降低，耐过猪常会出现发育受阻。成年猪常为隐性感染，妊娠母猪表现为流产、木乃伊胎、弱仔及呼吸系统症状；公猪表现为繁殖障碍和呼吸系统症状。育肥猪生长受阻。PRV感染猪肾脏有针尖状出血；胃黏膜卡他性炎症，出血；取患病病例的脑和脊髓制成组织切片，苏木素-伊红染色后观察呈弥漫性非化脓性脑膜炎。中枢神经系统出现血管套及胶质细胞坏死；淋巴细胞内有嗜酸性核内包涵体。
2 病原学诊断方法
病毒的分离鉴定（VI）是诊断该病的“黄金标准”。采集病样的脑、扁桃体、肾和脾等组织剪碎后研磨，经灭菌处理且加有抗生素的平衡盐溶液或生理盐水稀释后接种在培养成单层的适宜细胞上，观察直至出现特征性细胞病变。一般情况下，2~5天即可分离到病毒。有病变的细胞用H.E染色，镜检可观察到嗜酸性核内包涵体，也可进一步以电镜等方法鉴定。
3 免疫学诊断方法
3.1 检测PRV抗原的免疫学诊断方法
该法是将抗原或抗体用荧光素进行标记，通过荧光显微镜观察所标记的荧光，从而分析示踪相应的抗体或抗原。黄骏明等（1995）建立的荧光抗体染色技术可以直接检测自然感染、组织培养及实验感染的病料中的PRV，同时还做了阻断试验和RV、HEV、CDV、TGEV、PEDV、BVDV、BEFV等类症的交叉检测实验，证明了该法具有较高的特异性和敏感性。该法目前是我国对猪伪狂犬病快速诊断的一种好办法。
RPHA是一种利用抗体致敏红细胞在其相应抗原的作用下，发生红细胞凝集从而来测定抗原的诊断方法。吴平等（1991）通过利用单克隆抗体致敏的绵羊红细胞建立反向间接血凝和血凝抑制试验检测PRV，共计66份样本。该法与血清中和试验（SN）的符合率达94.4%，与VI的符合率为76.5%，RPHA结果准确、操作简便，可取代中和试验作为一种PRV的常规诊断技术。
该法是将单抗的特异性与ELISA结合起来，从而使其特异性和敏感性大大提高。苗得园等建立了由单抗介导的检测PRV的单抗夹心ELISA方法，最低病毒检出量为8.9微克/毫升，特异性局。对于自然感染猪及可疑病猪的检出率均达70%以上。该法将特异性单抗和生物素-亲和素系统引入传统的ELISA中，使其特异性和敏感性均得以提高，是一种较好的猪伪狂犬病诊断方法。
汪招雄等（2006）在PRV特异性单抗的基础上建立了双抗体夹心间接ELISA方法，检测PRV抗原，灵敏度达0.156微克/毫升。批内和批间变异系数分别为4.1%和6.39%。双抗体夹心间接ELISA法具有敏感性高、特异性强和重复性好及不与其他常见病原体产生交叉反应等特点，对比PCR平行检测了159份临床样本，发现该法比PCR敏感。双抗夹心ELISA检测PRV时，设备要求低，操作简单，是临床诊断和进出口检疫的主要方法。
3.2 检测PRV抗体的免疫学诊断方法
Inaba将PRV抗原抗体混匀在
该法是检测病毒较经典的血清学方法，也是大多数国家检测PRV的法定方法之一。相比SN而言，MSN可直接在微量培养板上进行检测，更适合于大批量的检测。方六荣等采集了华中地区24个猪场共计426份血清，应用MSN进行检测，测得阳性血清171份，占总量40.1%。检测结果较理想，但由于中和试验耗时较长，技术要求相对较高，因此比较适合实验室诊断以及检测中心使用。
Papp-Vid等创建了对流免疫电泳方法（CIE）检测猪PRV血清抗体，该方法特异性好，无交叉反应。与SN法相比，克服了血液污染、溶血及细胞毒素等问题，具有敏感、快速及对样品要求不高等优点，适合大批量样品的筛选检测工作。与双向免疫电泳相比，CIE能减少交叉反应。Williams等（1984）以标准的病毒中和试验做参考，对比研究了CIE和微量免疫扩散试验（MID）对PRV抗体检测的效果，结果两者敏感性相近，但均不如病毒中和试验（VN）敏感。但是CIE和MID对血清质量要求不如VN高。但CIE表现出较佳的快速诊断优势。对于阳性样品，VN需要3~4天产生细胞病变，MID需要12~34小时，而CIE在I~2小时内即可观察到特异的沉淀线。因此CIE更适合大规模PRV抗体监测。
AGID的原理是抗原和抗体在琼脂中自由扩散相遇后发生肉眼可见的沉淀。操作简单、特异性好。何启盖等应用AGID检测临床送检血清并将其与MSN作比较，两种试验方法检测102份血清样品，阳性数基本相符。孙刚等、代明娟等以及孙广力等将AGID用于猪伪狂犬血清抗体的检测，并与LAT、SN进行了比较，结果表明AGID是一种简便、准确、快捷的检测PRV血清抗体的方法，可用于对PR的流行病学调查和免疫动态监测。
Afshar等用纯化的PRV做抗原包被ELISA板，建立了检测PRV血清抗体的间接ELISA方法。结果显示该法在检测PRV感染产生的早期抗体敏感性方面优于传统的血清中和实验。Ao等用壁赤酵母表达系统高效表达的PRV糖蛋白gE主要抗原区制作包被抗原建立了间接ELISA方法，经交叉试验和Western blot等试验证实特异性良好，重复性高。与商业试剂盒同时对348份田间血清样品进行检测，检测结果无显著差异。邱德新等用HRP标记纯化的兔抗猪IgG制备出高效价的酶标抗体，建立了检测猪PR血清抗体的间接ELISA，与进口的PRV抗体检测ELISA诊断试剂盒检测结果检出符合率达100%。且其敏感性略高、特异性和重复性较好，可进行批量检测。
Prud’homme等（1997）将PRV gD基因插入杆状病毒载体中进行表达，制备重组抗原，建立了竞争ELISA（cELISA）。利用该法能监测到PRV感染后14天猪血清阳转的情况。与SN共同对80份猪血清PRV抗体进行检测，cELISA特异性为100%，粗制裂解抗原的敏感性为98%，在植物凝聚素提纯抗原情况下的敏感性为96%。Gut等报道，用杆状病毒表达系统表达的PRV糖蛋白gE和gI构建了cELISA，对245份阴性血清和165份阳性血清检测表明，该法比其他检测方法具有更高的敏感性和特异性。另外，cELISA还可用于早期感染的检测。
4 分子生物学诊断技术
4.1 聚合酶链式反应（PCR）
Belak等于1989年率先建立了用PCR检测PRV的方法。孙德刚等（2007）依据gD基因序列设计引物建立了检测猪PRV的PCR方法，并对25份疑似病料进行检测，检出阳性率达30%，通过检测结果及特异性和敏感性实验发现此检测方法敏感度很高。由于PCR需要对病料进行特殊处理，且其特异性还受到引物合理性的影响，不合理的引物会增加非特异性反应，甚至无法扩增出特异性片段。此外PCR还需要相应的设备，这导致其应用范围受到很大的限制。
Scherba等创建了区分PRV野毒株与疫苗株的PCR诊断方法。Katz等针对gE、TK基因设计复合套式PCR，能将PRV野毒株和疫苗株有效地分开。Hasebe等根据gD和gE-gI基因序列设计了两对引物，将5株野毒以及人工感染Bartha、BUK株进行扩增，能有效地区分强弱毒株。针对Bartha-K61 gI/gE双基因缺失疫苗，刘莉娜等针对PRV的gB、gD和gE基因序列建立了多重PCR鉴别诊断方法，有效地区分野毒株和疫苗毒，可检出756pg野毒株与106pg三基因缺失疫苗毒。
该法改进了原有PCR存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等。Schang等根据PRV gE、gD基因序列设计两对引物，同时设计一对用于扩增猪核因子I基因的引物，分别扩增PRV和猪的DNA，利用Southern转印杂交、高效液相色谱分析扩增产物，建立了定量和鉴别PCR技术。利用该法检测PRV两个毒株（gE+/gK‑/TK-和gE-/gG+/TK+）在猪三叉神经节中潜伏感染的情况，其敏感度达3个PRV基因拷贝/微克总DNA。Thiery等（1996）建立了检测PRV急性和潜伏感染猪三叉神经节中DNA的荧光素标记定量PCR方法，其灵敏度为5个PRV基因组拷贝数/106宿主细胞，与Schang等建立的放射性标记探针定量PCR方法的效果大致相同。
4.2 核酸探针技术
DNA探针特异性强、敏感性高，已广泛应用于PR的诊断。核酸杂交技术不仅可以检测到血清学诊断阳性的病料，还可以检测出呈潜伏感染状态的病毒DNA。Brown等建立了检测感染猪体内PRV DNA的原位杂交法，将制成的PRV特异性DNA标记的探针，通过原位杂交法检测组织中的PRV。Robin等使用微量滤管将从组织抽提的DNA转移到NC膜上，在高压条件下与猪细胞DNA无交叉杂交反应的探针进行斑点杂交，检出PRV潜伏感染。郭万柱等分别用32P标记和地辛高标记的核酸探针对多种毒株进行监测，其结果与PCR检测的结果相符，能检测出10pg PRV DNA。王小强等（2007）問利用原位杂交技术制备了寡聚核酸芯片，并根据计算机软件系统进行数据比较，一次即可快速准确、高效的检测包括PRV在内的四种常见猪病，相较现有的传染病检测技术该法是一个重要突破。
